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Gastrodin inibisce la proliferazione delle cellule in cellule muscolari lisce vascolari e attenua la formazione di neointima in vivo astratto Liscia vascolare delle cellule muscolari (VSMC) proliferazione svolge un ruolo critico nello sviluppo delle malattie vascolari. Nel presente studio, abbiamo testato l'efficacia e meccanismi di azione di gastrodin, un componente bioattivo della erba cinese Gastrodia elata Bl, in relazione al fattore-BB (PDGF-BB) proliferazione cellulare - dipendente e neointima di crescita derivato dalle piastrine formazione dopo danno vascolare acuta. esperimenti sulle cellule sono stati effettuati con VSMC isolate da aorte di ratto. saggi WST e incorporazione di BrdU sono stati utilizzati per valutare la proliferazione VSMC. Otto settimane di età topi C57BL / 6 sono stati utilizzati per gli esperimenti sugli animali. Gastrodin (150 mg / kg / giorno) è stato somministrato nella chow animali per 14 giorni, ed i topi sono stati sottoposti a lesione filo della carotide sinistra. I nostri dati hanno dimostrato che gastrodin attenuato la proliferazione VSMC indotta da PDGF-BB, come valutato dal saggio WST e incorporazione di BrdU. Gastrodin influenzato l'ingresso S-fase del VSMCs e stabilizzato espressione p27Kip1. Inoltre, pre-incubazione con Sinomenine prima di PDGF-BB stimolo ha portato ad una maggiore espressione del gene specifico per la muscolatura liscia, inibendo così VSMC dedifferentiation. trattamento Gastrodin anche ridotto l'area intimale e il numero di cellule PCNA-positivi. Inoltre, la fosforilazione di ERK1 / 2, p38 MAPK, Akt e GSK3 & # x003b2 PDGF-BB-indotto; è stato soppresso da gastrodin. I nostri risultati suggeriscono che gastrodin può inibire la proliferazione VSMC e attenuare neointimale in risposta al danno vascolare. Inoltre, il ERK1 / 2, p38 MAPK e Akt / GSK3 & # x003b2; vie di segnalazione sono stati trovati ad essere coinvolti negli effetti di gastrodin. Parole chiave: gastrodin, vascolare delle cellule muscolari lisce, la formazione di neointima, il fattore di crescita derivato dalle piastrine introduzione Liscia vascolare delle cellule muscolari (VSMC) proliferazione svolge un ruolo chiave nella patogenesi delle malattie vascolari, tra cui l'arteriosclerosi e restenosi dopo vena innesto o intervento coronarico (1 & # x02013; 3). Di conseguenza, le strategie antiproliferativi sono stati impiegati con successo per prevenire lo sviluppo di malattie proliferative vascolari. Lesioni provoca il rilascio di molteplici fattori di crescita e citochine che stimolano la proliferazione cellulare tramite diversi meccanismi di segnalazione (4). Dopo angioplastica, fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) ha dimostrato di essere un segnale importante che contribuisce alla apertura della risposta cellulare presto per infortunio. Pertanto, l'identificazione di nuovi composti che inibiscono PDGF-dipendente la proliferazione delle cellule hanno il potenziale per migliorare le strategie terapeutiche esistenti e limite di ritardo complicanze cardiovascolari, come ad esempio in-stent restenosi fallimento e bypass (5). Gastrodia elata Bl, una medicina tradizionale a base di erbe, è stato ampiamente utilizzato in Cina e Giappone per migliaia di anni (6). Gastrodin (p-idrossimetilfenil - & # x003b2; - D-glucopyranoside) è il principale componente bioattivo di Gastrodia elata Bl, ed è stato ampiamente utilizzato clinicamente per il trattamento della nevrastenia, vertigini, epilessia, emicrania, mal di testa e la demenza. Studi precedenti hanno dimostrato che gastrodin ha effetti farmacologici neuroprotettivi (7). Gastrodin protegge contro la tossicità indotta da ipossia in colture primarie di neuroni corticali di ratto (8), salva deficit di plasticità sinaptica indotta dal piombo nell'ippocampo di ratto (9), sopprime l'accumulo di calcio nelle cellule PC12 indotte dal trattamento glucosio e diminuisce cellule apoptosi nella linea cellulare PC12 dopo trauma I / R in vitro (10), e migliora l'apprendimento comportamento in un modello di ratto di Alzheimer e # x02019; s malattia indotta da intra-ippocampali a & # x003b2; 1 e # x02013; 40 di iniezione (11). Tuttavia, poco si sa circa gli effetti della gastrodin sulle malattie cardiovascolari e la formazione di neointima, e il funzionamento dei relativi meccanismi di segnalazione rimangono poco chiari. Pertanto, abbiamo affrontato se gastrodin attenua proliferazione VSMC indotta da PDGF-BB in vitro e / o la formazione di neointima nella carotide dopo trauma filo in vivo. Materiali e metodi materiale Gastrodin è stato acquistato da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). topo ricombinante PDGF-BB è stato acquistato da ProSpec (Rehovot, Israele). Gli anticorpi utilizzati per rilevare i livelli totali e la fosforilazione di ERK1 / 2, p38, AKT, GSK-3 & # x003b2; e STAT3 sono stati ottenuti da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anticorpi specifici per p27Kip1, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) e proliferazione antigene nucleare di cellule (PCNA) sono stati acquistati da Cell Signaling Technology. Anti-SM22 & # x003b1; e anti-muscolo liscio - & # x003b1; actina (SMA) sono stati acquistati da Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-desmina e anti-smoothelin sono stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). inibitore della proteasi completa, PhosSTOP, Cell Proliferation ELISA, 5-bromo-2 & # x02032; - deoxyuridine (BrdU) (colorimetrico) e la proliferazione cellulare reagente WST-1 kit sono stati acquistati da Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Germania). Altri reagenti sono stati acquistati da Sigma-Aldrich, salvo specificato. Per gli studi in vitro, gastrodin viene sciolto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), e PBS solo servito come controllo. Coltura cellulare VSMC ratto sono stati isolati enzimaticamente dalle aorte toraciche di ratti Sprague-Dawley. Queste cellule sono state coltivate in terreno / F12 DMEM contenente 10% siero bovino fetale e sono stati identificati come VSMC di muscolo liscio - & # x003b1; actina (SMA) immunostaining, come precedentemente descritto (12, 13). VSMC sono state coltivate per 60 & # x02013; 80% di confluenza e sono stati siero-fame per 24 ore. Tre esperimenti indipendenti sono stati analizzati per tutti i dati visualizzati. VSMC da passaggi 5 a 12 sono stati utilizzati per gli esperimenti in questo studio. La proliferazione cellulare e saggio della sintesi del DNA VSMC (5 & # x000d7, 10 3 / pozzetto) sono state seminate in una micropiastra a 96 pozzetti, cresciuto al 60% di confluenza e siero-fame per 24 ore. Dopo preincubazione con gastrodin per 1 h, le cellule sono state trattate con PDGF-BB (20 ng / ml) per 48 ore. la proliferazione cellulare e la sintesi del DNA sono stati valutati utilizzando commerciale colorimetrico non radioattivo WST-1 e kit di analisi incorporazione BrdU (Roche) secondo il produttore & # x02019; s istruzioni. è stata utilizzata la proliferazione cellulare reagente WST-1 per misurare l'accumulo del numero di VSMC vitali basate sulla scissione di sali di tetrazolio incubate nel mezzo di coltura. sintesi del DNA in VSMC è stata valutata mediante l'incorporazione di BrdU. Analisi citofluorimetrica della distribuzione del ciclo cellulare Le cellule sono state incubate con ioduro di propidio (PI) colorazione buffer e sono stati poi analizzati utilizzando un citofluorimetro (FACScan, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). G0 / G1, S e G2 / M percentuali di cellule sono state contate utilizzando il software AV Multicycle (Flow Systems Phoenix, San Diego, CA, USA). Western blotting VSMC sono stati trattati con gastrodin (200 & # x003bc; g / ml) per 2 h prima incubazione con 20 ng / ml di PDGF-BB per il tempo indicato. Le VSMC sono stati lisati in tampone RIPA con un cocktail proteasi e un cocktail fosfatasi (Roche). Gli estratti cellulari sono stati usati per SDS-PAGE e sono state poi trasferite su membrane di trasferimento Immobilon-FL (Millipore) e sondato con vari anticorpi. Le bande proteiche sono state poi incubate con un secondario IRDye & # x000ae; anticorpo 800CW coniugato e rilevato con un Imaging System Odyssey. Carotide modello di lesione filo Tutti i protocolli sperimentali sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida istituzionali sul benessere degli animali e sono stati approvati dal Comitato Etico a Renmin Hospital dell'Università di Wuhan. Otto settimane di età topi maschi C57 / BL6 sono stati alimentati con normale chow chow roditori o contenente 0,09% gastrodin (w / w) per 14 giorni prima di un infortunio filo. Con questo chow, i topi sono stati alimentati e # x0223c; 150 mg di gastrodin / kg / giorno. Per l'intervento pregiudizio fili, i topi sono stati anestetizzati con una iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (90 mg / kg). L'arteria carotide sinistra è stato esposto e in loop sul ramo esterno utilizzando una sutura 8-0 seta. Un angiotomy è stata eseguita in arteria carotide interna, e un filo guida metallico dritto (0,38 mm di diametro, C-SF-15-15, Cook, Bloomington, IN, USA) è stato inserito verso l'arco aortico e poi passati in avanti e ritirate 5 volte con un movimento rotatorio, come precedentemente descritto (14). L'arteria carotide controlaterale servito come controllo. I topi sono stati mantenuti sul rispettivo chow fino a quando furono sacrificati e trattati per studi morfologici nei punti temporali indicati dall'intervento iniziale. analisi istologiche e morfometriche Le arterie carotidi sono state raccolte 28 giorni post-infortunio. Gli animali sono stati sacrificati con una iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico eccessiva. Successivamente, le arterie sono state rimosse, fissate con 4% paraformaldeide in PBS per almeno 16 h ed inclusi in paraffina senza ulteriore dissezione. Sezioni seriali (5 & # x003bc; m) sono stati creati attraverso il sito di lesione, & # x0223c; 300 & # x003bc; m dai rami della carotide sinistra. Le aree del intima e dei media sono stati misurati in H & # x00026; sezioni in modo cieco e-macchiati da un singolo osservatore utilizzando Immagine-Pro Plus Software 6.0 (Media Cybernetics). Un valore medio è stato determinato dopo aver valutato almeno 4 sezioni da ogni topo. formazione della neointima è stato definito come il rapporto tra l'area intimale a quella della zona mediale (I / M). Per l'analisi immunoistochimica PCNA, le sezioni sono state preincubate con 5% di siero normale di capra e poi incubate con anticorpi anti-PCNA anticorpo monoclonale (1: 100, non 2586, CST.). Le sezioni sono state poi incubate con un anticorpo biotinilato secondario streptavidina-perossidasi di rafano seguito da diaminobenzidina (kit DAB, Dako), dopo di che le sezioni sono state contrastate con ematossilina. Per controlli negativi, l'anticorpo primario è stato sostituito con PBS. Il valore medio di almeno 3 sezioni / mouse è stato utilizzato per rappresentare quantitativamente il numero di cellule PCNA-positive che erano presenti nelle pareti dei vasi feriti. Analisi statistica I risultati sono stati espressi come media & # x000b1; SEM. L'analisi statistica è stata effettuata da analisi della varianza ad una via (ANOVA), seguita da Dunnett & # x02019; s Test per confronti multipli. Un valore p & # x0003c; 0.05 è stato considerato per indicare differenze statisticamente significative. risultati Ruolo di gastrodin in VSMC proliferazione Per prima studiato l'effetto di gastrodin sulla proliferazione utilizzando un saggio WST-1 proliferazione cellulare. Gastrodin e PDGF-BB sono stati sciolti in mezzo privo di siero per questi esperimenti. cellule quiescenti sono stati pre-trattati con gastrodin (50 & # x02013; 200 & # x003bc; g / ml; Sigma-Aldrich) per 1 ora prima della stimolazione PDGF-BB (20 ng / ml; ProSpec). stimolazione PDGF-BB aumento della proliferazione VSMC da & # x0223c; 2,5 volte rispetto al gruppo di controllo a 48 h. Gastrodin proliferazione VSMC marcatamente inibito in modo dose-dipendente (Fig. 1A). saggi di incorporazione di BrdU sono stati usati per approfondire lo studio degli effetti della gastrodin sulla sintesi del DNA. Gastrodin inibito significativamente l'incorporazione di BrdU indotto dalla stimolazione PDGF-BB in modo dose-dipendente (Fig. 1B). Inoltre, gastrodin trattamento in assenza di PDGF-BB non diminuiva la vitalità delle VSMC o loro incorporazione di BrdU rispetto alle cellule di controllo, indicando che gastrodin trattamento a queste concentrazioni non ha effetti citotossici sulle VSMC, e che l'effetto inibitorio gastrodin rivolge sintesi del DNA piuttosto che citotossicità per causare la perdita di DNA cellulare (Fig. 1A). trattamento Gastrodin impedisce VSMC proliferazione e la sintesi del DNA indotta dalla stimolazione PDGF-BB. VSMC sono state trattate con le concentrazioni indicate di gastrodin (50 & # x02013; 200 & # x003bc; g / ml) per 48 h in assenza o presenza di PDGF-BB (20 ng / ml). . Ruolo di gastrodin in progressione del ciclo cellulare La proliferazione cellulare è controllata dalla progressione attraverso il ciclo cellulare, che è regolata da molte cascate di segnalazione proliferativi. La progressione attraverso il ciclo cellulare richiede l'attivazione dei complessi ciclina / ciclina-dipendente proteina chinasi (CDK), che sono regolati da CDK proteine inibitorie (CKiS) come p27Kip1. Abbiamo analizzato gli effetti del trattamento gastrodin sulla distribuzione fase del ciclo cellulare di VSMCs. Come mostrato mediante citometria di flusso, la stimolazione PDGF-BB aumentato significativamente la percentuale di cellule in fase S e diminuita la percentuale di quelli nelle fasi G0 / G1, considerando gastrodin (ad una concentrazione di 200 & # x003bc; g / ml) significativamente diminuito il numero di cellule in fase S e aumento della frazione di cellule G0 / G1-fase tra le VSMC (Fig. 2A). Questi dati indicano che gastrodin può impedire l'ingresso S-fase VSMCs. Abbiamo poi analizzato l'espressione di p27Kip1 mediante western blotting. p27Kip1 è risultato essere costitutivamente espresso in VSMC quiescenti, e la sua espressione era downregulated in seguito a stimolazione PDGF-BB. Per contro, il pretrattamento con gastrodin marcatamente ripristinata espressione p27Kip1 (Fig. 2B). trattamento Gastrodin previene la progressione del ciclo cellulare in VSMC. VSMC sono state coltivate con gastrodin (200 & # x003bc; g / ml) in assenza o presenza di PDGF-BB (20 ng / ml) per 24 ore, e la loro distribuzione fase del ciclo cellulare è stata valutata mediante citometria a flusso. (A) Quantificazione. Ruolo di gastrodin a commutazione fenotipo VSMC In risposta all'ambiente danno vascolare, VSMC può dedifferentiate in un fenotipo proliferativo che è caratterizzata da un aumento della proliferazione e diminuita espressione di marcatori muscolari lisce, come SMA, SM22 & # x003b1 ;, desmina e smoothelin. Così, abbiamo esaminato se gastrodin modula il fenotipo di VSMC in coltura. Dopo pretrattamento con gastrodin (200 & # x003bc; g / ml) per 2 ore, VSMC quiescenti sono state stimolate con PDGF (20 ng / ml) per 48 h in presenza / assenza di gastrodin. Western blotting è stato eseguito per rilevare l'espressione di SMA, smoothelin, SM22 & # x003b1; e desmina. stimolazione PDGF-BB ha ridotto i livelli di proteine della SMA, SM22 & # x003b1; e desmina (Fig. 3). Tuttavia, il pretrattamento con gastrodin invertito l'effetto repressivo della stimolazione PDGF-BB sull'espressione di SM - & # x003b1; actina, smoothelin e desmina. Questi dati indicano che gastrodin inibisce la capacità delle VSMC per passare nel fenotipo proliferativa in vitro. Effetti del trattamento gastrodin sulla regolazione di liscio genica muscolare. (A) VSMC sono state preincubate per 2 h con gastrodin (200 & # x003bc; g / ml) e quindi stimolate con PDGF (20 ng / ml) per 48 ore. I livelli della proteina di SMA, SM22 & # x003b1 ;, smoothelin. Ruolo di gastrodin in vie di segnalazione indotte da PDGF-BB Abbiamo poi esaminato il percorso di segnalazione (s) coinvolti nella effetto inibitorio di gastrodin su VSMC proliferazione in risposta alla stimolazione PDGF-BB. ERK1 / 2, p38 MAPK, Akt e GSK3 & # x003b2; fosforilazione sono stati ogni aumentata a 5 min trattamento post-PDGF-BB, e questo effetto persistito fino a 15 minuti trattamento post-PDGF-BB. Mentre la stimolazione PDGF-BB indotto la fosforilazione di ERK1 / 2, p38 MAPK, Akt e GSK3 & # x003b2 ;, queste modifiche erano significativamente inibiti da gastrodin a 15 min post-trattamento. I livelli totali di proteine di queste molecole di segnalazione non sono cambiati significativamente durante il corso della stimolazione con PDGF-BB in presenza o assenza di gastrodin (Fig. 4). Questi dati suggeriscono che i percorsi di segnalazione MAPK e Akt sono coinvolti negli effetti soppressivi del gastrodin sulla proliferazione delle VSMC in risposta a PDGF-BB. Effetti inibitori del trattamento gastrodin su MAPK, Akt / GSK-3 & # x003b2; e l'attivazione di STAT3 in VSMC PDGF-BB-stimolati. VSMC siero-fame sono state stimolate con PDGF-BB (20 ng / ml) per il tempo indicato in assenza o in presenza di gastrodin (200 & # x003bc; g / ml). . Ruolo della gastrodin nella formazione di neointima e la proliferazione delle cellule in vivo Abbiamo osservato che gastrodin potrebbe inibire la proliferazione delle VSMC, influenzare il loro progressione del ciclo cellulare, invertire il loro interruttore fenotipica e sopprimere le vie di segnalazione indotte da PDGF-BB. Questi risultati suggeriscono una applicazione terapeutica potente per la gastrodin contro la formazione di neointima in risposta al danno. Per confermare questa ipotesi, le arterie carotidi sinistra di topi sono stati feriti con un filo guida metallico per indurre un modello di neointima iperplasia. Neointima ispessimento 28 giorni seguenti lesioni filo è stato ridotto del 50% nel gruppo chow-fed gastrodin rispetto al normale gruppo di chow-fed. VSMC proliferazione in vivo è stata caratterizzata secondo la colorazione immunoistochimica con un anticorpo PCNA. Gastrodin consumo chow diminuita significativamente la risposta proliferazione indotta da lesione arteriosa, come il numero di cellule PCNA-positivi era più di 2 volte maggiore (P & # x0003c; 0,01) nel gruppo normale chow-fed rispetto al gastrodin gruppo chow-fed (Fig. 5). alimentazione Gastrodin impedisce la formazione neointima indotta da lesioni filo guida. (A e B) Rappresentante H & # x00026; E colorazione e (C e D) immagini PCNA colorazione immunoistochimica delle arterie carotidi feriti da entrambi i topi di controllo alimentati o gastrodin. Discussione Il presente studio dimostra per la prima volta che gastrodin trattamento inibisce la proliferazione VSMC indotta da PDGF-BB in vitro e sopprime marcatamente neointimale dopo trauma filo in vivo. Questi effetti protettivi possono essere associati con un ampio spettro di vie di segnalazione, tra cui MAPK e Akt / GSK3 & # x003b2 ;. Queste osservazioni suggeriscono che gastrodin può avere effetti benefici per la protezione contro la formazione neointima associato con l'arteriosclerosi e restenosi dopo intervento coronarico percutaneo (PCI) e la vena innesto. Gastrodin, il principale componente bioattivo di Gastrodia elata Bl, ha effetti protettivi potenti contro il sistema nervoso ed è stato comunemente prescritti dai medici cinesi per il trattamento della nevrastenia, vertigini, epilessia, emicrania, mal di testa e la demenza. Sebbene il trattamento gastrodin ha dimostrato di avere molti effetti farmacologici neuroprotettivi, poco si sa circa gli effetti della gastrodin sulla malattia vascolare e la proliferazione cellulare. Luo et al (15) ha riferito che gastrodin potrebbe inibire la proliferazione VSMC in vitro. come numeri VSMC e H 3 - TdR incorporazione diminuite significativamente in modo dose-dipendente in seguito al trattamento con gastrodin o un'iniezione con Gastrodia elata Bl. Tuttavia, tale relazione non determinare se gastrodin potrebbe inibire la proliferazione VSMC indotta da mitogeni, che è una componente importante del processo patologico di varie malattie vascolari (5, 16 e # x02013; 18). In questo studio, abbiamo dimostrato che il trattamento gastrodin soppresso l'aumento del numero delle cellule e il DNA costitutivo derivante dalla stimolazione PDGF-BB. Inoltre, la proliferazione cellulare è controllato da un gran numero di segnalazione proteine che regolano il ciclo cellulare mitotico. p27Kip1, una proteina inibitoria CDK (CKI), svolge un ruolo chiave nel controllo del ciclo cellulare in risposta a vari processi patofisiologici (19 & # x02013; 21). Nelle cellule quiescenti, p27Kip1 è altamente tradotto e dimostra espressione stabile. Dopo stimolazione mitogenica, p27Kip1 viene rapidamente downregulated, che permette l'attivazione di CDK complessi / ciclina e la successiva attivazione trascrizionale di geni necessari per la transizione G1 / S e l'inizio della replicazione del DNA (20). Tuttavia, l'effetto del gastrodin sulla modulazione del ciclo cellulare non è stato esaminato. In questo studio, abbiamo riscontrato che gastrodin può influenzare l'/ S G transizione del ciclo cellulare e stabilizzare p27Kip1, che viene degradata dopo stimolazione PDGF-BB. Oltre ad agire come un mitogeno VSMC, PDGF-BB è un potente regolatore negativo di differenziazione VSMC. VSMC sono notevolmente plastica in risposta ai cambiamenti ambientali locali indotte da danno vascolare (22). La de-differenziazione delle VSMC è associata ad aumentato drammaticamente la proliferazione cellulare, la migrazione e la capacità di sintesi, e svolge un ruolo critico nella neointimale. Nel nostro studio, abbiamo scoperto che gastrodin trattamento potrebbe ripristinare la soppressione della muscolatura liscia (SM) l'espressione genica - marker indotta da PDGF-BB, indicando che gastrodin significativamente colpisce la manifestazione del fenotipo VSMC in vitro. I meccanismi con cui gastrodin esercita i suoi effetti anti-proliferativi rimangono poco chiari. Dai et al (7) ha riportato che gastrodin potrebbe inibire l'espressione di NO sintasi inducibile, microglia cicloossigenasi-2 e citochine proinfiammatorie in coltura LPS-stimolati attraverso le vie MAPK. MAPKs hanno dimostrato di svolgere ruoli importanti nella proliferazione delle cellule PDGF-BB-indotta in molti tipi di cellule (23). E 'stato anche riportato che PDGF-BB induce la fosforilazione di Elk-1 attraverso ERK1 / 2, e che fosforilata Elk-1 compete con SRF per il legame ad elementi CArG entro i promotori di SMC geni marcatori, come SM22 & # x003b1; e SMA (24). Pertanto, abbiamo studiato l'effetto del trattamento gastrodin sulla fosforilazione di MAPK tre indotte dalla stimolazione PDGF-BB in VSMC. Abbiamo osservato che la fosforilazione di ERK1 / 2 e p38 è stato rapidamente e notevolmente indotta in VSMC in seguito alla stimolazione PDGF-BB, mentre gastrodin pretrattamento soppresso questi effetti, che indica che l'inibizione del segnale di MAPK è coinvolta negli effetti anti-proliferativi di gastrodin. Studi precedenti hanno dimostrato che i fattori di crescita come PDGF-BB facilitano la fosforilazione di Akt in VSMC. Inoltre, Akt regola la sopravvivenza e la proliferazione cellulare in una varietà di tipi cellulari (25, 26). Di conseguenza, la trasfezione di un mutante dominante negativo Akt (DN-Akt) è stato trovato per attenuare iperplasia attraverso l'inibizione della proliferazione VSMC e l'inversione di VSMC dedifferentiation (27, 28). E 'ben noto che GSK3 & # x003b2; è un substrato di Akt e che ha attivato Akt può fosforilare GSK3 & # x003b2; e diminuire la sua attività catalitica (29). GSK3 & # x003b2; fosforila ciclina D1 a T286, che dirige la sua degradazione proteolitica. L'attività catalitica di GSK3 & # x003b2; è inibita dalla fosforilazione di Akt-dipendente, e Akt-mediata GSK3 & # x003b2; fosforilazione stabilizza ciclina D1 (30). attivazione di Akt media anche l'ubiquitinazione e la degradazione di p27Kip1 in risposta a mitogeni stimolazione mediante la upregulation di SKP2, un componente chiave del complesso ubiquitina ligasi SCF SKP2. Inoltre, Bonnet et al (31) ha dimostrato che l'inibizione di Akt / GSK3 & # x003b2; segnalazione / NFAT in risposta a PDGF potrebbe sopprimere la proliferazione VSMC e invertire il rimodellamento lesioni indotte. In linea con le precedenti relazioni, abbiamo osservato un marcato aumento dell'attività di Akt e la fosforilazione del suo substrato GSK3 & # x003b2; in VSMC PDGF-BB-stimolata. Inoltre, il pretrattamento con gastrodin facilitato la defosforilazione di Akt e GSK3 & # x003b2 ;, e stabilizzato p27Kip1. Questi risultati indicano che il Akt / GSK3 & # x003b2; percorso di segnalazione è parzialmente coinvolto nelle effetti inibitori di gastrodin trattamento sulla proliferazione VSMC. In conclusione, questo studio ha dimostrato chiaramente che gastrodin trattamento attenua proliferazione VSMC PDGF-BB-indotta in vitro e formazione della neointima lesioni indotte in vivo. Gastrodin protegge contro la proliferazione VSMC impedendo il passaggio del ciclo cellulare G / S, sopprimendo la VSMC interruttore fenotipica proliferativa e inibendo ERK1 / 2, p38 e Akt / GSK3 & # x003b2; segnalazione. Pertanto, riteniamo che gastrodin è un forte candidato per la terapia efficace nella prevenzione delle malattie proliferative vascolari. Ringraziamenti Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione di Scienze Naturali della provincia di Hubei della Cina (senza 2010CDB06203.); il soggetto principale del Dipartimento di Salute della provincia di Hubei della Cina (senza JX4A02.); la National Science Foundation naturale della Cina (senza 81.000.342.); Fondi speciali per le spese di ricerca di base e di funzionamento di Central University (n. 4.101.032) Riferimenti 1. Doran AC, Meller N, McNamara CA. Ruolo delle cellule muscolari lisce della iniziazione e la progressione precoce di aterosclerosi. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008; 28: 812-819. 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